ESTUDIO DE LIPROPROTEÍNAS PLASMÁTICAS Y SU RELACION CON LA ATEROSCLEROSIS EN EL PINGUINO

INTRODUCCIÓN

El conocimiento de la bioquímica de las lipoproteínas plasmáticas (LP) en el hombre, ha llevado en las últimas décadas a una mejor comprensión del desarrollo de la aterosclerosis (6,35,41). La importancia de la alimentación en el desarrollo de la aterosclerosis y su efecto sobre las lipoproteínas tanto en el hombre (5, 23), como en la experimentación animal (7, 42), ha sido demostrada. Dichos conocimientos se han enriquecido con los estudios realizados sobre el tema en aves (37), especialmente en la paloma (8), el pollo (15), la gallina (33), el gallo (4), el pavo (29), el ganso (30) y el quail japonés (36). Dentro de estos estudios no hemos encontrado referencias sobre la bioquímica de las lipoproteínas/ni sobre estudios angiográficos realizados con el fin de poner de manifiesto la aterosclerosis en el pingüino.

Por lo antedicho en el presente trabajo se efectúan estudios angiográficos, bioquímicos (lipoproteínas) y anátomo-patológicos sobre la presencia de aterosclerosis en el pingüino en estado salvaje en su hábitat natural, la Antártida.

MATERIAL Y MÉTODOS

Se estudiaron 15 pingüinos de tres especies: 5 Pigoscelis Adelia, 5 Pigoscelis Papua y 5 Pigoscelis Antártico con un peso mayor de 4 kilogramos, con plumas, no pudiéndose determinar las edades. Fueron capturados en la base Artigas (Shetland del Sur) en el bimestre diciembre-enero, durante el período de reproducción y con alimentación natural de peces y krill (11), en una temperatura ambiental entre 0 Y -15ºC.

Los pingüinos fueron anestesiados con pentobarbital sódico, 40-50 mg/kg, i/p, obteniéndose la sangre por punción de vena braquial, separándose el plasma por centrifugación y colocado en bolsas plásticas de 50 mi de capacidad, conservándolas a -1 0ºC.
Posteriormente, a cada ejemplar se le realiza una descubierta en cuello, se exponen ambas carótidas y mediante el método de seldinger se realizan distintas arteriografías en: cráneo, cuello, tórax y abdomen. Se sacrificaron 3 pingüinos, uno de cada especie con sobredosis de pentobarbital. Se les extrajeron muestras de arterias: aorta, subclavia, carótidas, cervicales y coronarias que, colocadas en formol al 10 %, fueron transportadas al Uruguay, junto con los plasmas, para su estudio. Además se estudiaron como referencia 20 muestras de plasmas humanos, 10 hombres y 10 mujeres sin riesgo coronario, cuyas edades oscilaban entre los 30 y 50 años.

Las arterias con -un promedio de 20 fragmentos en cada caso, fueron incluidas en parafina y estudiadas histológicamente con las tinciones de hematoxilina-eosina y el tricrómico de Cajal Gallego modificado para fibras elásticas.

La dosificación de colesterol total (CT) se realizó por método enzimático, utilizando un kit de laboratorio Wiener (32), los triglicéridos (TG) por el método colorimétrico de laboratorio Wiener (34), fosfolípidos totales (PL) por el método enzimático de laboratorio Bio-Mérieux (44) y ácidos grasos libres (AGL) según el método colorimétrico de Duncom-be (13). Los estudios electroforéticos de las LP (LEF) fueron realizados en acetato de celulosa según técnica descrita (1).

La LP de alta densidad (HDL) fue precipitada selectivamente según la técnica de Lopez Virella (25) y la LP de baja densidad (LDL) utilizando un kit de laboratorio Bio-Mérieux (18) dosificando en ellos CT y PL según el método indicado. Las LP fueron separadas, para estudio de su composición / por ultracentrifugación / flotación según el método de Hatch y col. (19). En las fracciones obtenidas HDL, LDL y LP de muy baja densidad (V LDL) se dosificó CT, TG y PL según las técnicas mencionadas y proteínas totales (PT) por el método de Lowry (28) utilizándose albúmina humana como standard.

Los Lípidos totales del plasma y de las diferentes fracciones fueron extraídos por el método de Folch, cloroformo / metanol, 2:1 (v/v) (16) y los lípidos neutros, separados por cromatografía en capa fina en sílica gel G (Merck), con éter de petróleo / éter etílico / ácido acético, 90:10:1 (v/v) (27). Sé utilizó como standard colesterol libre, colesterol oléalo, trioleína, ácido esteárico y dipalmitoil fosfatidilcolina (Sigma). Las manchas fueron reveladas con vapores de iodo.

Los PL del plasma total y de las diferentes fracciones fueron precipitados por acetona de los lípidos totales extraídos por el método de Folch (16) y separados en cromatografía en capa fina en sílica gel G (Merk) con cloroformo / metanol / ácido acético / agua, 25:15:4:2 (v/v) (40). Se utilizó como standards dipalmitoil fosfatidilcolina y esfingomielina (Sigma).

Las manchas fueron visualizadas con vapores de iodo, raspadas dentro del tubo y se determinó el contenido de fosfato según la técnica colorimétrica de laboratorio Wiener (20).

La composición apolipoproteica (apo-LP) se estudió mediante electroforesis en poliacrilamida al 10 % con dodecil sulfato de sodio (PAA-SDS) en tubo, teñido con Cromasie Brillant Blue al 0,25 %, empleando la técnica de Weber y Osborn (43). Se utilizó como standards un kit Sigma MV-SDS-70 que contiene lisozima (PM 14.300), beta lactoglobulina (PM 18.400), tripsinógeno (PM 24.000), pepsina (PM 34.700) ovo albúmina (PM 45.000) y albúmina bovina (PM 66.000).

Los estudios estadísticos fueron procesados mediante el test de comparación de dos medias (en variables independientes), test de Student.

RESULTADOS

Mediante el estudio exhaustivo de las angiografías realizadas en el laboratorio de la base Artigas con un equipo portátil de Rayos X (transportado especialmente para realizar dichos estudios) se observó la ausencia de lesiones ateroscleróticas evidenciables angiográficamente en carótidas, subclavias, aorta y ramas.

Se comprobó histológicamente que la estructura de los vasos arteriales de mayor calibre corresponde a las arterias de tipo "elástico".En ellas la capa media está constituida por una serie concéntrica de láminas elásticas de espesor uniforme, entre las que se dispone el tejido conjuntivo y las células musculares lisas. En la parte periférica se aprecia un conjuntivo laxo con pequeños vasorum.

Las arterias de menor calibre (carótidas, coronarias) son de tipo "muscular" característico. En ellas se observa una nítida limitante elástica interna, sobre la que reposa el revestimiento endotelial con un tejido subendotelial prácticamente virtual.

La capa media está formada en su mayor parte por células musculares lisas y por fuera se aprecian varias capas irregulares de fibras elásticas de la limitante elástica externa. Por último una adventicia constituida por tejido conjuntivo laxo.

Cuando se estudió un paquete vásculo-nervioso, se vio que éste está constituido por una arteria, dos venas satélites y un nervio sin caracteres especiales a destacar.

En ninguno de los casos, en los distintos cortes de las diversas arterias estudiadas se observó la existencia de lesiones ateromatosas.

Los valores plasmáticos de CT, TG, PL y AGL se muestran en la Tabla I, siendo los tres primeros más bajos en el pingüino que en el hombre y el último más alto, correspondiendo éste a los P. Papuas, dado que los AGL son los únicos valores que presentaron diferencias entre las especies, siendo en los P. Papuas de 0,40 :+ 0.14, P. Antártico 0.15 ^ 0,07 y P. Adelia0.13±0.09g/l.

En las Tablas II y III se observan los valores de HDL-C, HDL-PL y LDL-C, LDL-PL y su relación, destacándose el alto contenido en HDL y el bajo en LDL en el pingüino en comparación al hombre, pero manteniéndose sus relaciones constitucionales C/PL

Las diferencias entre el metabolismo del colesterol entre el pingüino y el hombre se muestran en la Tabla IV, que refleja lo indicado en las Tablas II y 111. De estas tablas se deduce que la HDL corresponde un 70 %, la LDL un 20 % y la VLDL un 10 % de las LP totales del pingüino.

En la Fig. 5 se observan los LEF destacándose la baja, casi ausente fracción VLDL (prebeta LP) y el alto porcentaje de HDL (alfa LP) en el pingüino con relación al hombre, así como la mayor fracción Rho(AGL unidos a la albúmina). La composición de las LDL, y HDL se muestran en la Tabla V, siendo los índices I ípidos / proteínas en el pingüino 3,8:9,2:1,5 y en el hombre 4,1:10,5:1,0 respectivamente. La Fig. 6 muestra los LEF de las fracciones aisladas por ultracentrifugación / flotación, como índice de pureza de las mismas. En la Fig. 7, cromatografía en capa fina de Iípidos neutros, se observa la presencia de dos manchas a nivel del colesterol esterificado (CE) en el pingüino, no presentes en el hombre tanto en el plasma total como las fracciones LP separadas. El raspado y detección en las mismas de colesterol, por la reacción de Lieberman-Burchard, según la técnica de Stern y col. (38) fue positiva,

El fraccionamiento cromatográfico de los PL se muestra en la Fig. 8 y en la Tabla VI. El perfil PL del pingüino es semejante al del hombre presentando la HDL una relación fosfatidilcolina / esfingomielina de 7 es decir 2,3 veces mayor que la LDL que es de 3; dicha relación en la HDL es más marcada que en el hombre. La LDL del pingüino muestra una mayor concentración de PL a nivel de la banda correspondiente al fosfatidilinositol que en el hombre que es 8,9 %.

En la Fig. 9, electroforesis en PAA-SDS de la HDL y LDL. Se observa cómo las LP procedentes del pingüino presentan un número mayor de bandas que en el hombre. La LDL muestra una apo-LP mayor, con un PM mayor de 66.000 daltons (mínima penetración en el gel PAA utilizado) y varias menores con un PM entre 30.000 y 66.000 daltons.

La HDL muestra una apo-LP de PM=~30.000 daltons con un Rf semeiante a la correspondiente al polipéptido A1 del plasma humano y varias menores, tres de PM entre 35.000 y 66.000, una de PM mayor de 66.000 y una de PM=~15.000 daltons.
 

COMENTARIOS Y DISCUSIÓN

Los ácidos grasos de más de 10 carbonos absorbidos en el intestino son transportados en las aves, a diferencia del hombre y otros mamíferos, por vía porta y vehiculizados en la circulación sistémica en los triglicéridos de la VLDL, motivo por el cual no encontramos en ninguno de los pingüinos estudiados quilomicrones y sí amplias variaciones de VLDL (1 -20 %) dependiendo las mismas del ayuno existente en el momento de la captura (por analogía con los quilomicrones (QM) del hombre, se los llama portomicrones (4)). Esta baja concentración de VLDL en el pingüino también ha sido mencionada en otras aves como por ej.: el pavo (22), habiendo sido sugerido la eficiencia del sistema lipolítico vascular en prevenir la acumulación de VLDL en el plasma (21), sumado en el pingüino a las necesidades de su utilización energética, dadas las condiciones especiales de su medio ambiente.

La HDL representa, según los resultados, la mayor lipoproteína circulante en el pingüino. También ha sido indicado en el pavo (22), el pollo, el ganso y la paloma (9-30). Este hecho unido a la baja concentración de LDL en el pingüino, de cumplir ambas las mismas funciones que en el hombre, es decir, LDL aporte de colesterol a los tejidos periféricos y HDL distribución corporal del colesíero) y su depuración a nivel hepático, explicaría la ausencia de aterosclerosis encontrada en estas aves en estado salvaje (2-12). Es de destacar que no sólo no apareció la típica plata de ateroma, sino que tampoco se observó el más mínimo engrosamiento del tejido conectivo subendotelial ni se apreció la existencia de posibles indicios histopatológicos de envejecimiento vascular (desdoblamiento, fragmentación o engrosamientos irregulares de la limitante elástica interna, fibrosis de la media).

La constitución lipídica relativa de las diferentes fracciones LP del pingüino es semejante a otras aves (10). Es de destacar que en su composición al igual que en el plasma total, los pingüinos presentan, a nivel de cada LP, 2 manchas de estéridos en la cromatografía en capa fina. Este perfil lipídico cromatográfico puede estar relacionado a los ácidos grasos proporcionados por la alimentación especial del pingüino: peces (ricos en ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga) y krill (pobre en lípidos) o corresponder a diferentes esteróles. Otros autores no han hecho referencia a este hecho en sus estudios en aves (10, 22)

La relación fosfatidilcolina / esfingomielina en el pingüino es mayor en la HDL que en la LDL, al igual que en Otras aves (10, 22) y en el hombre (39), siendo en nuestro estudio más marcada la relación en el pingüino que en el hombre. La LDL presenta un aumento de PL a nivel del fosfatidilinositol que necesita mayores estudios para una inequívoca caracterización.

El perfil apo-LP de la LDL del pingüino, muestra diferencia con el humano (2, 3), presentando además de la fracción mayor de PM (66.000 daltons), ubicada a la altura de la apo-LPB humana, fracciones menores, indicando la heterogeneidad de la densidad de la LDL (1.006-1.063g/l), datos observados en otras aves (10,22)

El perfil apo-LP de la HDL( densidad 1.063-1.210g/l)del pingüino, muestra también diferencias con el humano al presentar una fracción mayor de PM (30.000 daltons) y fracciones menores, siendo necesarios estudios de las subfracciones de la HDL para una mejor comprensión e interpretación de dichos datos (2, 3, 14, 31).

En conclusión: los pingüinos no presentan lesiones ateroscleróticas evidenciables ni por la radiología ni por la anatomía patológica. Además presentan una constitución en lípidos de sus LP con particularidades metabólicas lipídicas propias, semejantes a otras aves. Esto, sumado a aspectos propios de su perfil apo-LP y de la composición en CE, esta última posiblemente relacionada con su alimentación en estado salvaje así como a las situaciones especiales de su ambiente natural, la Antártida, explicarían la ausencia de aterosclerosis en los mismos.