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Trabajos Científicos:  

EFECTOS DEL KRILL ANTARTICO (Euphasia Superba)
1996 - 97

 EFECTOS DEL KRILL ANTÁRTICO (Euphasia Superba) SOBRE LA COLAGENOGÉNESIS EN ATEROMA EXPERIMENTAL

 

RESUMEN

Se estudiaron 20 conejos divididos en cinco grupos de 4 animales, alimentando al grupo I (control) con dieta balanceada. Los otros cuatro grupos recibieron dieta hipercolesterolémica durante tres meses, estando suplementada la del grupo II con 10% de krill total, dieta que contiene 150 mg de ácidos grasos omega 3/100 g. Los grupos II y III se sacrificaron al cabo de tres meses, mientras que los grupos IV y V, al cabo de ese lapso recibieron durante tres meses más dieta balanceada (grupo IV) o dieta balanceada con krill (grupo V).

En esos materiales se procedió a realizar la detección de colágenos de tipo I, III, IV y VII mediante los antisueros monoclonales específicos (Chemtron) que reconocieron los mismos epítopes en el colágeno del conejo. La detección final se realizó con estreptavidina-biotina-peroxidasa. Se estudió, en las secciones de la aorta de los animales del grupo control la distribución de los colágenos, que fue similar a la encontrada en secciones de aorta humana obtenidas en la necropsia de dos pacientes de menos de 30 años de edad fallecidos por causas traumáticas. El colágeno I mostró marcación positiva moderada en la capa media, en forma similar al colágeno VII y algo del IV. Este último destacaba en la membrana basal endotelial. El colágeno III parecía estar localizado fundamentalmente en la adventicia.

En el engrosamiento con lipófagos a nivel subendotelial, que constituyen las capas de ateroma en etapa inicial de evolución de los grupos II y III, el colágeno presente es fundamentalmente del tipo ni. En las placas evolucionadas de los animales del grupo V se agrega únicamente colágeno del tipo IV, rodeando las células musculares y fibromusculares que han proliferado. Las placas muestran una textura homogénea, sin estratificación. Por el contrario, las placas maduras de los animales del grupo IV son estratificadas, con escaso colágeno del tipo III y gran predominio de colágeno tipo I, metabólicamente más estable. El colágeno de tipo VII estuvo ausente de las placas de todos los animales experimentales.

En definitiva, el krill en la dieta a través, entre otros, de su contenido en ácidos grasos omega 3, modifica la colagenogénesis en la fase cicatrizal de la placa de ateroma, manteniendo una placa homogénea con colágeno tipo III, menos estable y con mayor posibilidad de recuperación "at integrum".

INTRODUCCIÓN

Los estudios internacionales han permitido documentar que las poblaciones que se alimentan en base a productos de origen marino, son las que presentan una menor morbimortalidad cardiovascular, vinculando este comportamiento, entre otros, al contenido en ácidos grasos de la serie omega 3 de esos productos (1.2).

El Krill Antártico (Euphasia Superba) producto de origen marino, produce a nivel arterial modificaciones del desarrollo de la placa de ateroma y de su regresión experimental en el conejo alimentado con dieta hipercolesterolémica. Estas modificaciones se caracterizan en el desarrollo, por la formación de una placa con una matriz intersticial finamente fibrilar y amorfa relacionando a colágeno joven neodepositado y en la regresión se observa ausencia de fibrosis densa y aparición de una matriz de material alcianófilo (3).

Frente a estas modificaciones cualitativas, el objetivo de este trabajo es determinar las características colagénicas de dichas placas en ambas situaciones, desarrollo y regresión del proceso aterogénico y de esta forma adquirir una mejor comprensión del proceso y del efecto de los productos de origen marino sobre la aterogénesis.

MATERIALES Y MÉTODOS

Animales Utilizados

Se utilizaron 24 conejos albinos neozelandeses de 2,5 y 3 kg que fueron divididos en 5 grupos con dietas diferentes:

Grupo I: 4 animales con alimentación balanceada para conejo (Villamil S.A., Montevideo)
(Tabla I)
Grupo II: 4 animales con alimentación balanceada enriquecida con colesterol al 1% W/W.
 
Grupo III: 4 animales con alimentación balanceada y krill al 10% W/W, enriquecida con colesterol al 1% W/W.
Grupo IV: 4 animales con alimentación balanceada, que habían recibido previamente durante 12 semanas alimentación enriquecida con colesterol al 1% W/W.
Grupo V: 4 animales con alimentación balanceada y krill al 10% W/W, que habían recibido previamente durante 12 semanas alimentación balanceada enriquecida con colesterol al 1% W/W.


Toda la alimentación fue suministrada en forma de pellets "ad libitum" al igual que el agua. A las 12 semanas de implantadas las dietas, todos los animales fueron sacrificados.

TABLA I: COMPOSICIÓN DE LA DIETA BALANCEADA

Mínimo de: Proteínas 16 %
Extracto al éter 3 %
Magnesio 40g/ton
     
Máximo de: Humedad 12,5 %
Fibras 15 %
Minerales Totales 6,5 %
Cloruro de Sodio 0,6 %
Cornezuelo de Centeno 0,03 %
     
Máximo y mínimo: Calcio 0,09 a 1,3 %
Fósforo 0,07 a 1,05 %

(Elaborada por VILLAMIL S.A., Montevideo).

Estudios químicos de las dietas

A los cuatro tipos de dietas utilizadas: I) alimentación balanceada, II) alimentación balanceada enriquecida con colesterol al 1% W/W, III) alimentación balanceada y krill al 10% W/W, enriquecida en colesterol al 1% W/W y IV) alimentación balanceada y krill al 10% W/W, se les valoró: humedad, proteínas, lípidos, colesterol, cenizas y contenido en ácidos grasos, especialmente de la serie W-3.
El porcentaje de humedad se calculó por doble pesada, hasta el peso constante post-secado. Las proteínas se dosificaron por el método de Kjeldahí (4) y los lípidos fueron extraídos por el método de Folch cloroformo-metanol 2:1 (V/V) (5), valorando al contenido total por pesada, previa evaporación del solvente.
El contenido en fibras se calculó a través de la pérdida de peso por ignición del residuo seco remanente de una digestión acida (4). Las cenizas fueron valoradas por el método de calcinación. La valoración del colesterol total (CT) se realizó sobre una alícuota del extracto lipídico obtenido por el método de Folch, dosificándose CT por el método enzimático de la colesterol oxidasa-peroxidasa (6).
La evaluación de los ácidos grasos se realizó sobre una alícuota del extracto lipidico previa metilación con trifluoruro de boro metanol (Sigma) (7).
Se utilizaron como estándares, sometidos al mismo tratamiento de mediación:
ácido mirístico (C 14:0), ácido palmítico (C 16:0), ácido palmitoleico (C 16:1), ácido esteárico (C 18:0), ácido araquídico (C 20:0), ácido behénico (C 22:0), ácido oleico (C 18:1), ácido linoleico (C 18:2), ácido linolénico (C 18:3), ácido eicosaenoico (C 20:1), ácido eicosadienoico (C 20:2), ácido eicosatrienoico (C 20:3), ácido araquidónico (C 20:4), ácido decosapentaenoico (C 22:5) y los de la serie W-3, ácidos octadecatetraenoicos (ODA) (C 18 4D, 6,9,12,15), ácido eicosapentaenoico (EPA) (C 20:5D, 5,8,11,14,17) y ácido doxahexaenoico (DHA) (C 22.-6D, 4, 7,10,13,16,19) (8) todos los productos Sigma.
La separación cromatográfica se realizó en un cromatógrafo de fase gaseosa "Hitachi 263-50", en columna de vidrio de 2 mm x 3 mm de DI, empaquetada con succionado de dietilen-glicol al 15% sobre Uniport B (Gosojuro Konyo) malla 60/80, a temperatura de 185° C con una velocidad de flujo de 45 ml/min de N2 y en detector de ionización de llama. La valoración de cada ácido graso se realizó por estimación de áreas utilizando un módulo integrado computarizado (cromatopac) marca "Shimadzu", modelo "C-RSA".

Estudios bioquímicos

Se extrajeron muestras de sangre por punción cardiaca de todos los animales, separando el suero por centrífuga y guardándolo a -20° C hasta su estudio.

Se dosificó CT por método enzimático (6), triglicéridos (TG) por método enzimático (9) y el colesterol unido a las lipoproteínas de alta densidad (HDL-C) por precipitación selectiva según la técnica de López Virella (10). El colesterol no unido a HDL (no HDL-C) se valoró por diferencia: no HDL-C = CT-HDL.C (11).

Estudios inmunohistoquímicos

Las aortas de todos los conejos y fragmentos toráxicos y abdominales de aortas humanas obtenidas por necropsia de 2 pacientes menores de 30 años fallecidos por causas traumáticas, fueron fijados en formalina tamponada al 10% para incluirlos en parafina. Para la detección del colágeno se realizaron cortes de 6 mieras de espesor y se levantaron en láminas silanizadas que fueron tratadas con tampón citrato en homo de microondas y tripsinización posterior.
Sobre este material se procedió a la detección de colágenos de tipo I, II, III, IV y VII mediante el uso de los antisueros monoclonales específicos (Chemtron) dirigidos contra los mismos, realizándose la detección final con estreptavidina-biotina-peroxidasa con AEC como cromógeno (12). En cortes de 6 mieras de espesor se realizó la coloración de: Hemalum-Eosina, PAS-Alcian Blue con digestión diastástica, Orceína para elástico y Wildeer para fibras (13).
Otras secciones de las aortas realizadas con mícrotomo de congelación, fueron teñidas con Oil Red 0-Hemalum para visualizar células con contenido lipidico.

Análisis estadístico

Los resultados de las dietas son expresados por X de los cuadriplicados realizados en cada caso.
Para todos los valores se utilizó para calcular la significación estadística el Test de Student para la comparación de grupos no apareados (14).

RESULTADOS Dietas

La tabla II muestra la composición de las diferentes dietas, observándose que no existen modificaciones en los contenidos globales de proteínas y lípidos en ninguna de ellas ni del contenido de glúcidos, que corresponde a la diferencia al 100% del alimento, siendo de 50,09; 48,70; 47,43 y 46,64 g/100 g respectivamente en las dietas I, II, III y IV.
 

TABLA II
COMPOSICIÓN DE LAS DIETAS
DIETAS (*)    I II III IV
Proteínas 16,4 16,2 14,2 14,0
Lípidos 5,9 6,8 6,1 7,0
Colesterol 0,11 0,80 0,07 0,76
Fibras 9,0 9,0 7,9 7,8
Minerales 6,5 6,5 7,1 7,0
Humedad 12,0 12,0 17,2 17,0
(*)X(g/100g)

En la tabla III se observa que la composición de los ácidos grasos de las dietas, siendo la diferencia a destacar la correspondiente al contenido en ácidos grasos de la serie W-3,132-164 mg/100 g de alimento, mientras que no se detectan en las dietas sin krill (dietas l y ll).
 

TABLA III

COMPOSICIÓN RELATIVA DE LOS ÁCIDOS GRASOS DE LAS DIETAS

ÁCIDOS GRASOS (*) Dietas I y II Dietas III y IV
C14:0 1.7 2.0
C16:0 30.5 32.0
C16:1 1.5 1.5
C18:0 5.8 5.6
C18:1 32.0 32.4
C18:2 27.5 23.2
C20:2 0.0 1.8
C22:6 0.0 0.4
Otros 1.0 1.1
(*)X(%)

Estudios lipídicos plasmáticos

Los estudios lipídicos plasmáticos muestran (tabla IV) que el CT aumentó significativamente (p<0.001) en los grupos II y ni en relación al grupo I, a expensas de no HDL-C. Los grupos IV y V vuelven a sus valores básales (grupo I).

TABLA IV

ESTUDIOS LIPÍDICOS PLASMÁTICOS DE CONEJOS CON DIFERENTES DIETAS

Groups TC(..) HDL-C(..) non HDL-C(..) TG(..)
I 1.60 ± 0.80 0.30 ± 0.10 1.18 ± 0.70 0.85 ± 0.23
II 8.02 ± 2.23 0.40 ± 0.18 7.61 ± 2.16 * 1.05 ± 0.66
III 8.86 ± 1.97 * 0.20 ± 0.15 8.65 ± 1.78 * 1.19 ± 0.90
IV 1.54 ± 0.70 0.27 ± 0.09 1.27 ± 0.61 0.80 ± 0.26
V 1.28 ± 0.70 # 0.25 ± 0.09 1.06 ± 0,32 # 0,80 ± 0,28 #
(*) P 0,001 en relación al Grupo I
(#) No significa en relación al Grupo IV
(..) X(g/l)


Estudios inmunohistoquímicos

La distribución de los colágenos en la aorta del grupo control (I), fue similar a la encontrada en las secciones de aortas humanas. El colágeno tipo I mostró marcación positiva moderada en la capa media, en forma similar al colágeno VII y algo del IV.

Este último destacaba en la membrana basal endotelial. El colágeno tipo III parecía estar localizado fundamentalmente en la adventicia.


En el engrosamiento con lipófagos a nivel subendotelial que constituye las placas de ateroma en etapas iniciales de evolución, de los grupos II y III el colágeno presente es fundamentalmente de tipo III (figura 1) con menor contenido en el grupo III (dieta enriquecida con colesterol más krill), el colágeno tipo VII mantiene su positividad en la capa media (figura 2).

En la regresión del proceso en las placas evolucionadas de los animales del grupo V (figura 3) se agrega únicamente colágeno tipo IV, rodeando las células musculares y fibromusculares que han proliferado. Las placas muestran una textura homogénea sin estratificación. Por el contrario las placas evolucionadas de los animales del grupo IV presentan un casquete fibroso, son estratificadas, con escaso colágeno de tipo III y gran predominio de colágeno de tipo I (figura 4).

El colágeno tipo VII estuvo ausente de las placas de todos los animales experimentales.

COMENTARIOS Y DISCUSIÓN

La distribución de los tipos de colágeno en la pared vascular normal del conejo y humana es similar. El Krill Antártico (Euphasia Superba) crustáceo rico en ácidos grasos de la serie W-3 (15), produce modificaciones de la aterogénesis por un aporte del mismo de 140-160 mg/día para 3 kg peso animal caracterizadas, en el desarrollo de la placa, por formación de una placa menor colagénica, con predominio del colágeno neoformado de tipo III, así como menor contenido lipidico (1,2).

Todo sucede como si la evolución natural de la placa a su reparación "ad integrum" se acelerara, en ausencia de la concentración masiva de lipófagos y de la fibrogénesis de las células musculares lisas.

La regresión de la placa es también distinta en los animales que secundariamente reciben krill (grupo V), en relación a los que reciben sólo dieta balanceada (grupo IV). En los animales del grupo IV se aprecia una peculiar estructura estratificada de las placas, con núcleo fibroso denso y casquetes igualmente fibrosos construidos predominantemente por colágeno tipo I (figura 4).

La presencia de colágeno tipo I, denso y no alcianófilo, indica una remodelación más dificultosa (16).

En los animales del grupo V, por lo contrario, además de menor cantidad de material lipídico y menos lipófagos (1-3) la aparición de una matriz rica en material alcianófilo, constituido por colágeno tipo III, con proliferación superficial de células musculares constituye una matriz más adecuada para una reparación al reemplazar (17), al casquete fibroso (colágeno tipo I) encontrado en los animales del grupo IV (18).

Tratándose el Krill Antártico de un alimento complejo las modificaciones producidas en la colagenogénesis en la fase cicatrizal de la placa de ateroma que mantiene una placa homogénea con colágeno tipo III, menos estable y más fácilmente remodelable, no debe ser atribuida solamente al contenido en ácidos grasos de la serie W-3 (19) y sus propiedades anti-inflamatorias-inmunológicas (20), sino además a otras sustancias con posible papel protector de la aterogénesis como lo son el ácido oleico, el selenio, el zinc, el magnesio y las astazantinas entre otras (21,22).

AGRADECIMIENTOS

Nuestro reconocimiento al personal del bioterio del Instituto Antártico Uruguayo por su colaboración y a la Sra. Rossana Pioli por la confección de este manuscrito.

 

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