RESUMEN
Se
estudiaron 20 conejos divididos en cinco
grupos de 4 animales, alimentando al
grupo I (control) con dieta balanceada.
Los otros cuatro grupos recibieron dieta
hipercolesterolémica durante tres
meses, estando suplementada la del grupo
II con 10% de krill total, dieta que
contiene 150 mg de ácidos grasos omega
3/100 g. Los grupos II y III se
sacrificaron al cabo de tres meses,
mientras que los grupos IV y V, al cabo
de ese lapso recibieron durante tres
meses más dieta balanceada (grupo IV) o
dieta balanceada con krill (grupo V).
En esos materiales se procedió a
realizar la detección de colágenos de
tipo I, III, IV y VII mediante los
antisueros monoclonales específicos (Chemtron)
que reconocieron los mismos epítopes en
el colágeno del conejo. La detección
final se realizó con estreptavidina-biotina-peroxidasa.
Se estudió, en las secciones de la
aorta de los animales del grupo control
la distribución de los colágenos, que
fue similar a la encontrada en secciones
de aorta humana obtenidas en la
necropsia de dos pacientes de menos de
30 años de edad fallecidos por causas
traumáticas. El colágeno I mostró
marcación positiva moderada en la capa
media, en forma similar al colágeno VII
y algo del IV. Este último destacaba en
la membrana basal endotelial. El colágeno
III parecía estar localizado
fundamentalmente en la adventicia.
En el engrosamiento con lipófagos a
nivel subendotelial, que constituyen las
capas de ateroma en etapa inicial de
evolución de los grupos II y III, el
colágeno presente es fundamentalmente
del tipo ni. En las placas evolucionadas
de los animales del grupo V se agrega únicamente
colágeno del tipo IV, rodeando las células
musculares y fibromusculares que han
proliferado. Las placas muestran una
textura homogénea, sin estratificación.
Por el contrario, las placas maduras de
los animales del grupo IV son
estratificadas, con escaso colágeno del
tipo III y gran predominio de colágeno
tipo I, metabólicamente más estable.
El colágeno de tipo VII estuvo ausente
de las placas de todos los animales
experimentales.
En definitiva, el krill en la dieta a
través, entre otros, de su contenido en
ácidos grasos omega 3, modifica la
colagenogénesis en la fase cicatrizal
de la placa de ateroma, manteniendo una
placa homogénea con colágeno tipo III,
menos estable y con mayor posibilidad de
recuperación "at integrum".
INTRODUCCIÓN
Los
estudios internacionales han permitido
documentar que las poblaciones que se
alimentan en base a productos de origen
marino, son las que presentan una menor
morbimortalidad cardiovascular,
vinculando este comportamiento, entre
otros, al contenido en ácidos grasos de
la serie omega 3 de esos productos
(1.2).
El Krill Antártico (Euphasia Superba)
producto de origen marino, produce a
nivel arterial modificaciones del
desarrollo de la placa de ateroma y de
su regresión experimental en el conejo
alimentado con dieta hipercolesterolémica.
Estas modificaciones se caracterizan en
el desarrollo, por la formación de una
placa con una matriz intersticial
finamente fibrilar y amorfa relacionando
a colágeno joven neodepositado y en la
regresión se observa ausencia de
fibrosis densa y aparición de una
matriz de material alcianófilo (3).
Frente a estas modificaciones
cualitativas, el objetivo de este
trabajo es determinar las características
colagénicas de dichas placas en ambas
situaciones, desarrollo y regresión del
proceso aterogénico y de esta forma
adquirir una mejor comprensión del
proceso y del efecto de los productos de
origen marino sobre la aterogénesis.
MATERIALES
Y MÉTODOS
Animales
Utilizados
Se utilizaron 24 conejos albinos
neozelandeses de 2,5 y 3 kg que fueron
divididos en 5 grupos con dietas
diferentes:
Grupo
I: |
4
animales con alimentación
balanceada para conejo (Villamil
S.A., Montevideo)
(Tabla I) |
Grupo
II: |
4
animales con alimentación
balanceada enriquecida con
colesterol al 1% W/W.
|
Grupo
III: |
4
animales con alimentación
balanceada y krill al 10% W/W,
enriquecida con colesterol al 1%
W/W. |
Grupo
IV: |
4
animales con alimentación
balanceada, que habían recibido
previamente durante 12 semanas
alimentación enriquecida con
colesterol al 1% W/W. |
Grupo
V: |
4
animales con alimentación
balanceada y krill al 10% W/W,
que habían recibido previamente
durante 12 semanas alimentación
balanceada enriquecida con
colesterol al 1% W/W. |
Toda la alimentación fue suministrada
en forma de pellets "ad libitum"
al igual que el agua. A las 12 semanas
de implantadas las dietas, todos los
animales fueron sacrificados.
TABLA
I:
COMPOSICIÓN DE LA DIETA BALANCEADA
Mínimo
de: |
Proteínas |
16
% |
Extracto
al éter |
3
% |
Magnesio |
40g/ton |
|
|
|
Máximo
de: |
Humedad |
12,5
% |
Fibras |
15
% |
Minerales
Totales |
6,5
% |
Cloruro
de Sodio |
0,6
% |
Cornezuelo
de Centeno |
0,03
% |
|
|
|
Máximo
y mínimo: |
Calcio |
0,09
a 1,3 % |
Fósforo |
0,07
a 1,05 % |
(Elaborada
por VILLAMIL S.A., Montevideo).
Estudios
químicos de las dietas
A
los cuatro tipos de dietas utilizadas: I)
alimentación balanceada, II) alimentación
balanceada enriquecida con colesterol al
1% W/W, III) alimentación balanceada y
krill al 10% W/W, enriquecida en
colesterol al 1% W/W y IV) alimentación
balanceada y krill al 10% W/W, se les
valoró: humedad, proteínas, lípidos,
colesterol, cenizas y contenido en ácidos
grasos, especialmente de la serie W-3.
El porcentaje de humedad se calculó por
doble pesada, hasta el peso constante
post-secado. Las proteínas se
dosificaron por el método de Kjeldahí
(4) y los lípidos fueron extraídos por
el método de Folch cloroformo-metanol
2:1 (V/V) (5), valorando al contenido
total por pesada, previa evaporación
del solvente.
El contenido en fibras se calculó a
través de la pérdida de peso por
ignición del residuo seco remanente de
una digestión acida (4). Las cenizas
fueron valoradas por el método de
calcinación. La valoración del
colesterol total (CT) se realizó sobre
una alícuota del extracto lipídico
obtenido por el método de Folch,
dosificándose CT por el método enzimático
de la colesterol oxidasa-peroxidasa (6).
La evaluación de los ácidos grasos se
realizó sobre una alícuota del
extracto lipidico previa metilación con
trifluoruro de boro metanol (Sigma) (7).
Se utilizaron como estándares,
sometidos al mismo tratamiento de
mediación:
ácido mirístico (C 14:0), ácido palmítico
(C 16:0), ácido palmitoleico (C 16:1),
ácido esteárico (C 18:0), ácido araquídico
(C 20:0), ácido behénico (C 22:0), ácido
oleico (C 18:1), ácido linoleico (C
18:2), ácido linolénico (C 18:3), ácido
eicosaenoico (C 20:1), ácido
eicosadienoico (C 20:2), ácido
eicosatrienoico (C 20:3), ácido araquidónico
(C 20:4), ácido decosapentaenoico (C
22:5) y los de la serie W-3, ácidos
octadecatetraenoicos (ODA) (C 18 4D,
6,9,12,15), ácido eicosapentaenoico (EPA)
(C 20:5D, 5,8,11,14,17) y ácido
doxahexaenoico (DHA) (C 22.-6D, 4,
7,10,13,16,19) (8) todos los productos
Sigma.
La separación cromatográfica se realizó
en un cromatógrafo de fase gaseosa
"Hitachi 263-50", en columna
de vidrio de 2 mm x 3 mm de DI,
empaquetada con succionado de dietilen-glicol
al 15% sobre Uniport B (Gosojuro Konyo)
malla 60/80, a temperatura de 185° C
con una velocidad de flujo de 45 ml/min
de N2 y en detector de ionización de
llama. La valoración de cada ácido
graso se realizó por estimación de áreas
utilizando un módulo integrado
computarizado (cromatopac) marca "Shimadzu",
modelo "C-RSA".
Estudios
bioquímicos
Se
extrajeron muestras de sangre por punción
cardiaca de todos los animales,
separando el suero por centrífuga y
guardándolo a -20° C hasta su estudio.
Se dosificó CT por método enzimático
(6), triglicéridos (TG) por método
enzimático (9) y el colesterol unido a
las lipoproteínas de alta densidad (HDL-C)
por precipitación selectiva según la técnica
de López Virella (10). El colesterol no
unido a HDL (no HDL-C) se valoró por
diferencia: no HDL-C = CT-HDL.C (11).
Estudios
inmunohistoquímicos
Las
aortas de todos los conejos y fragmentos
toráxicos y abdominales de aortas
humanas obtenidas por necropsia de 2
pacientes menores de 30 años fallecidos
por causas traumáticas, fueron fijados
en formalina tamponada al 10% para
incluirlos en parafina. Para la detección
del colágeno se realizaron cortes de 6
mieras de espesor y se levantaron en láminas
silanizadas que fueron tratadas con tampón
citrato en homo de microondas y
tripsinización posterior.
Sobre este material se procedió a la
detección de colágenos de tipo I, II,
III, IV y VII mediante el uso de los
antisueros monoclonales específicos (Chemtron)
dirigidos contra los mismos, realizándose
la detección final con estreptavidina-biotina-peroxidasa
con AEC como cromógeno (12). En cortes
de 6 mieras de espesor se realizó la
coloración de: Hemalum-Eosina, PAS-Alcian
Blue con digestión diastástica, Orceína
para elástico y Wildeer para fibras
(13).
Otras secciones de las aortas realizadas
con mícrotomo de congelación, fueron
teñidas con Oil Red 0-Hemalum para
visualizar células con contenido
lipidico.
Análisis
estadístico
Los
resultados de las dietas son expresados
por X de los cuadriplicados realizados
en cada caso.
Para todos los valores se utilizó para
calcular la significación estadística
el Test de Student para la comparación
de grupos no apareados (14).
RESULTADOS
Dietas
La
tabla II muestra la composición de las
diferentes dietas, observándose que no
existen modificaciones en los contenidos
globales de proteínas y lípidos en
ninguna de ellas ni del contenido de glúcidos,
que corresponde a la diferencia al 100%
del alimento, siendo de 50,09; 48,70;
47,43 y 46,64 g/100 g respectivamente en
las dietas I, II, III y IV.
TABLA
II |
COMPOSICIÓN
DE LAS DIETAS |
DIETAS
(*) |
I |
II |
III |
IV |
Proteínas |
16,4 |
16,2 |
14,2 |
14,0 |
Lípidos |
5,9 |
6,8 |
6,1 |
7,0 |
Colesterol |
0,11 |
0,80 |
0,07 |
0,76 |
Fibras |
9,0 |
9,0 |
7,9 |
7,8 |
Minerales |
6,5 |
6,5 |
7,1 |
7,0 |
Humedad |
12,0 |
12,0 |
17,2 |
17,0 |
(*)X(g/100g) |
En
la tabla III se observa que la composición
de los ácidos grasos de las dietas,
siendo la diferencia a destacar la
correspondiente al contenido en ácidos
grasos de la serie W-3,132-164 mg/100 g
de alimento, mientras que no se detectan
en las dietas sin krill (dietas l y ll).
TABLA
III |
COMPOSICIÓN
RELATIVA DE LOS ÁCIDOS GRASOS
DE LAS DIETAS
|
ÁCIDOS
GRASOS (*) |
Dietas
I y II |
Dietas
III y IV |
C14:0 |
1.7 |
2.0 |
C16:0 |
30.5 |
32.0 |
C16:1 |
1.5 |
1.5 |
C18:0 |
5.8 |
5.6 |
C18:1 |
32.0 |
32.4 |
C18:2 |
27.5 |
23.2 |
C20:2 |
0.0 |
1.8 |
C22:6 |
0.0 |
0.4 |
Otros |
1.0 |
1.1 |
(*)X(%) |
Estudios
lipídicos plasmáticos
Los estudios lipídicos plasmáticos
muestran (tabla IV) que el CT aumentó
significativamente (p<0.001) en los
grupos II y ni en relación al grupo I,
a expensas de no HDL-C. Los grupos IV y
V vuelven a sus valores básales (grupo
I).
TABLA
IV |
ESTUDIOS
LIPÍDICOS PLASMÁTICOS DE
CONEJOS CON DIFERENTES DIETAS
|
Groups |
TC(..) |
HDL-C(..) |
non
HDL-C(..) |
TG(..) |
I |
1.60
± 0.80 |
0.30
± 0.10 |
1.18
± 0.70 |
0.85
± 0.23 |
II |
8.02
± 2.23 |
0.40
± 0.18 |
7.61
± 2.16 * |
1.05
± 0.66 |
III |
8.86
± 1.97 * |
0.20
± 0.15 |
8.65
± 1.78 * |
1.19
± 0.90 |
IV |
1.54
± 0.70 |
0.27
± 0.09 |
1.27
± 0.61 |
0.80
± 0.26 |
V |
1.28
± 0.70 # |
0.25
± 0.09 |
1.06
± 0,32 # |
0,80
± 0,28 # |
(*)
P 0,001 en relación al Grupo I |
(#)
No significa en relación al
Grupo IV |
(..)
X(g/l) |
Estudios
inmunohistoquímicos
La distribución de los colágenos en la
aorta del grupo control (I), fue similar
a la encontrada en las secciones de
aortas humanas. El colágeno tipo I
mostró marcación positiva moderada en
la capa media, en forma similar al colágeno
VII y algo del IV.
Este último destacaba en la membrana
basal endotelial. El colágeno tipo III
parecía estar localizado
fundamentalmente en la adventicia.
En el engrosamiento con lipófagos a
nivel subendotelial que constituye las
placas de ateroma en etapas iniciales de
evolución, de los grupos II y III el
colágeno presente es fundamentalmente
de tipo III (figura 1) con menor
contenido en el grupo III (dieta
enriquecida con colesterol más krill),
el colágeno tipo VII mantiene su
positividad en la capa media (figura 2).
En la regresión del proceso en las
placas evolucionadas de los animales del
grupo V (figura 3) se agrega únicamente
colágeno tipo IV, rodeando las células
musculares y fibromusculares que han
proliferado. Las placas muestran una
textura homogénea sin estratificación.
Por el contrario las placas
evolucionadas de los animales del grupo
IV presentan un casquete fibroso, son
estratificadas, con escaso colágeno de
tipo III y gran predominio de colágeno
de tipo I (figura 4).
El colágeno tipo VII estuvo ausente de
las placas de todos los animales
experimentales.
COMENTARIOS
Y DISCUSIÓN
La distribución de los tipos de colágeno
en la pared vascular normal del conejo y
humana es similar. El Krill Antártico (Euphasia
Superba) crustáceo rico en ácidos
grasos de la serie W-3 (15), produce
modificaciones de la aterogénesis por
un aporte del mismo de 140-160 mg/día
para 3 kg peso animal caracterizadas, en
el desarrollo de la placa, por formación
de una placa menor colagénica, con
predominio del colágeno neoformado de
tipo III, así como menor contenido
lipidico (1,2).
Todo sucede como si la evolución
natural de la placa a su reparación
"ad integrum" se acelerara, en
ausencia de la concentración masiva de
lipófagos y de la fibrogénesis de las
células musculares lisas.
La regresión de la placa es también
distinta en los animales que
secundariamente reciben krill (grupo V),
en relación a los que reciben sólo
dieta balanceada (grupo IV). En los
animales del grupo IV se aprecia una
peculiar estructura estratificada de las
placas, con núcleo fibroso denso y
casquetes igualmente fibrosos
construidos predominantemente por colágeno
tipo I (figura 4).
La presencia de colágeno tipo I, denso
y no alcianófilo, indica una remodelación
más dificultosa (16).
En los animales del grupo V, por lo
contrario, además de menor cantidad de
material lipídico y menos lipófagos
(1-3) la aparición de una matriz rica
en material alcianófilo, constituido
por colágeno tipo III, con proliferación
superficial de células musculares
constituye una matriz más adecuada para
una reparación al reemplazar (17), al
casquete fibroso (colágeno tipo I)
encontrado en los animales del grupo IV
(18).
Tratándose el Krill Antártico de un
alimento complejo las modificaciones
producidas en la colagenogénesis en la
fase cicatrizal de la placa de ateroma
que mantiene una placa homogénea con
colágeno tipo III, menos estable y más
fácilmente remodelable, no debe ser
atribuida solamente al contenido en ácidos
grasos de la serie W-3 (19) y sus
propiedades anti-inflamatorias-inmunológicas
(20), sino además a otras sustancias
con posible papel protector de la aterogénesis
como lo son el ácido oleico, el
selenio, el zinc, el magnesio y las
astazantinas entre otras (21,22).
AGRADECIMIENTOS
Nuestro reconocimiento al personal del
bioterio del Instituto Antártico
Uruguayo por su colaboración y a la
Sra. Rossana Pioli por la confección de
este manuscrito.